热点剖析：RNA 修饰-m7G 发生机制及研究方法

 

  RNA 甲基化是目前研究最广泛的 RNA 表观遗传修饰，目前已有包括 N7 甲基鸟苷甲基化（m7G）在内的 70 余种 RNA 甲基化修饰方式被发现并报道。

  m7G 甲基化作为一种都会存在且进化保守的 RNA 修饰，在早前的研究中被认为主要发生在真核细胞 mRNA 的 5′ 端鸟苷 N7 位点，介导转录延长、mRNA 剪接、出核和翻译等过程。m7G 修饰通过影响各种 RNA 分子的代谢，包括 mRNA、tRNA、microRNA 和核糖体 RNA。慢慢的变多的证据说明，m7G 在人类疾病的发展中发挥着关键作用。

  目前 m7G 中标的项目慢慢的变多，但又不会像其他热点一样被研究的很泛滥，因此不失为基金申请的好方向。 下面本文将从背景介绍、研究手段、方法、结果分析等角度深入解析这一主题。

  7-甲基鸟嘌呤（m7G）修饰是一种常见的 RNA 修饰，主要存在于 tRNA、rRNA 和 mRNA 中，对 RNA 的稳定性、翻译效率和功能有重要影响。

  m7G 修饰是指在 RNA 分子中的鸟嘌呤（G）碱基的第七位氮原子上加上一个甲基基团，形成 7-甲基鸟嘌呤（m7G）。这种修饰可以发生在 RNA 分子的不同位置，如 mRNA 的 5 端帽子结构、tRNA 的反密码环和 rRNA 的特定位置。

  m7G 修饰通过酶促反应实现，这些酶通常被称为甲基转移酶。甲基转移酶使用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，将甲基基团转移到鸟嘌呤的第七位氮原子上，生成 m7G。

  功能：mRNA 的 5 端帽子结构（m7GpppN）是 eukaryotic mRNA 的典型特征，保护 mRNA 不被核酸外切酶降解，促进 mRNA 的核输出，参与翻译起始，并影响 mRNA 的转录和加工。

  合成：mRNA 帽子的合成由一系列酶促反应完成，包括 RNA 三磷酸酶、鸟嘌呤转移酶和甲基转移酶。这些酶协同作用，最终在 mRNA 的 5 端形成 m7G 帽子结构。

  功能：tRNA 中 m7G 修饰主要发生在反密码环区域，影响 tRNA 的结构和稳定能力，促进正确的密码子-反密码子配对，提高翻译的准确性和效率。

  合成：tRNA 中 m7G 的形成由特定的 tRNA 甲基转移酶（如 Trm8-Trm82 复合物）催化，这些酶识别特定的 tRNA 底物并进行甲基化修饰。

  功能：在 rRNA 中，m7G 修饰参与核糖体的组装和功能，影响蛋白质合成的精度和效率。

  合成：rRNA 中的 m7G 修饰由 rRNA 甲基转移酶（如 Bud23）催化，这些酶在 rRNA 的特定位点进行甲基化修饰。

  RNA 稳定性：m7G 修饰保护 RNA 分子免受降解酶的作用，增加 RNA 的半衰期。

  翻译调控：m7G 帽子结构与翻译起始因子结合，促进翻译起始复合物的组装，提高翻译效率。

  RNA 加工与核输出：m7G 帽子结构在 RNA 加工和核输出过程中发挥及其重要的作用，影响 RNA 的成熟和运输。

  近年来，随着高通量测序技术和质谱分析技术的发展，人们对 m7G 修饰的分布、功能和调控机制有了更深入的认识。例如，研究之后发现 m7G 修饰在癌症、神经退行性疾病和病毒感染等病理过程中起及其重要的作用，成为潜在的疾病标志物和治疗靶点。

  m7G 的研究涉及多种技术方法和检测指标，以解析其复杂的生化途径和调控机制。以下是一些关键的研究方法和技术：

  i）原理：薄层层析通过将样品在涂有吸附剂的薄层板上进行展开，不同化合物在薄层板上的迁移率不同，以此来实现分离和检测。

  ii）应用：m7G 修饰的 RNA 在薄层层析板上有特定的迁移率，通过与标准品对比能够直接进行定性检测。

  i）原理：高效液相色谱通过液相移动相和固定相之间的相互作用分离混合物中的成分。

  ii）应用：能够适用于分离和纯化 m7G 修饰的 RNA 片段，通过与标准品的保留时间作比较，实现 m7G 修饰的定性和定量分析。

  ii）应用：与液相色谱（LC-MS）或气相色谱（GC-MS）联用，可以精确检测 m7G 修饰的存在和位置，提供高灵敏度和高特异性的检测结果。

  i）原理：利用特异性抗体结合 m7G 修饰，通过荧光标记检测抗体-抗原复合物。

  ii）应用：适用于细胞和组织切片中 m7G 修饰的定位和定量分析，能够最终靠共聚焦显微镜观察修饰的空间分布。

  i）原理：利用 m7G 特异性抗体结合修饰核苷酸，通过酶标记检测抗体-抗原反应。

  i）原理：结合特异性抗体富集 m7G 修饰的 RNA 片段，接着进行高通量测序。

  ii）应用：可以在全基因组水平上检测 m7G 修饰的分布和频率，提供修饰在不同 RNA 分子中的精确位置。

  i）原理：使用特异性抗体对 m7G 修饰的 RNA 进行免疫共沉淀，接着进行 RNA 测序。

  ii）应用：适用于研究 m7G 修饰与特定蛋白质的相互作用，分析修饰对 RNA 功能的影响。

  i）原理：使用抗 m7G 抗体进行甲基化 RNA 的富集，接着进行高通量测序。

  ii）应用：大范围的使用在检测 mRNA 中 m7G 修饰的全局分布，揭示修饰的调控机制和生物学功能。

  i）原理：通过纳米孔阵列直接测序单分子 RNA，检测通过纳米孔的电流变化。

  ii）应用：纳米孔测序技术能够直接读取 RNA 分子的序列和修饰状态，实现单分子水平的 m7G 修饰检测，提供高分辨率和高灵敏度的数据。

  i）原理：利用荧光染料标记 RNA 分子，通过共振能量转移检测分子间的距离变化。

  ii）应用：能够适用于实时监测 m7G 修饰的动态变化，研究修饰对 RNA 结构和功能的影响。

  在这张图片中，显示了两种肝癌细胞系（Huh7 和 PLC/PRF/5）在两种不同条件下（Par 即对照组和 LR 即仑伐替尼耐药组）的几种蛋白的表达水平，这些蛋白包括 WDR4、METTL1、GAPDH（作为内参蛋白）、m7 G（7-甲基鸟苷），以及 U6（用作另一种内参）。Western Blot 的条带黑度反映蛋白的相对量，数值则提供了量化的比较。

  GAPDH 和 U6 通常用作内参，确保实验中蛋白质加载量的一致性。对比 GAPDH 和 U6 的表达稳定性来判断实验的可靠性。例如，Huh7 细胞中 GAPDH 在 Par 和 LR 之间表达变化不大，而 U6 表达在 LR 中略有下降。PLC/PRF/5 中 GAPDH 表达在 LR 稍微下降，U6 则在 LR 中略微上升。

  作为对照，显示加载的 RNA 总量是否相同。 各个点的染色强度相似，说明加载的 RNA 量基本一致，验证了上图检测结果的可靠性。

  m7G 信号：C4-2 细胞的斑点明显比 LNCaP 细胞的斑点更暗，表示 C4-2 细胞中 m7G 修饰水平更高。

  同样作为对照，显示加载的 RNA 总量是否相同。 各个点的染色强度相似，说明加载的 RNA 量基本一致，验证了上图检测结果的可靠性。

  定性分析： 从 m7G dot blot 图中能够准确的看出，LNCaP-AI 和 C4-2 细胞的 m7G 信号明显强于 LNCaP 细胞，表明 LNCaP-AI 和 C4-2 细胞中的 m7G 修饰水平更高。 Methylene blue 染色图显示每个点的染色强度基本一致，验证了 RNA 加载量的一致性，确保了 m7G 信号差异是由于修饰水平不同，而非 RNA 加载量不同。 进一步的定量分析能够最终靠斑点的灰度值进行定量，利用图像分析软件（如 ImageJ）测量每个斑点的灰度值，计算不同细胞系间 m7G 修饰水平的相对变化。

  总而言之，m7G 修饰在 RNA 稳定性、翻译效率和功能调控中发挥关键作用，近年来成为 RNA 修饰研究的热点。通过高通量测序和质谱分析等技术，科学家们深入解析了 m7G 的分布和机制，揭示其在癌症、神经退行性疾病和病毒感染等病理过程中的重要性。未来，m7G 修饰研究有望为疾病诊断和治疗提供新的靶点和思路，推动 RNA 生物学和医学领域的重大进展。

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